PCR试验结果不正确的原因分析

　　当PCR结果不甚满意时,首先检查以下几方面并遵照执行:

1、将PCR反应的试管与反应板紧贴。

2、当酶反应混合物以70℃"热启动"开始循环时,切记在加入酶后稍微振荡一下,因为在0.2-ml的PCR管中不能均匀传热。

3、不要随意减少dNTP的用量,它是一个系统的因素,必须与其它成份保持平衡。

4、对于有问题的PCR反应,例如模板的量少,模板不纯和环状模板等,先尝试加Taq酶前的体系进行预变性,后加模板进行正常PCR扩增。

5、没有扩增产物:在提供MgCl2缓冲液中,以0.25mmol/L为梯度增加MgCl2浓度；无MgCl2的缓冲液以0.5mmol/L为梯度增加MgCl2浓度。泳道中出现模糊条带,如果DNA模板中存在RNA,则按上述提示浓度补加MgCl2,因为在PCR反应中可能缺少游离的Mg2+。

6、检查退火温度和变性条件,如果有需要的话,可降低退火温度。

7、检查模板和引物的用量。

8、增加循环次数和/或模板DNA的用量。

9、泳道中出现模糊条带:减少循环次数或模板DNA的用量。

10、提高退火温度,但不要超过68℃。

11、重新设计引物或设计更长的引物。



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